چکیده مقدمه زهرا غلامپور - محمد زکی عقل

Journal of Plant Protection Vol. 30, No. 1, Spring 2016, P. 127-133 نشریه حفاظت گیاهان (علوم و صنایع کشاورزي) جلد 30 شماره 1 بهار 1395 ص 127-133. مقایسه روش هاي استخراج آر.آن. يا *2 1 زهرا غلامپور - محمد زکی عقل تاریخ دریافت: 1393/08/14 تاریخ پذیرش: 1394/05/24 چکیده وجود مقادیر زیاد ترکیبات فنلی و پلی ساکاریدها در بافتهاي مو از معضلات استخراج اسید نوکلي یک با کیفیت بالا از این گیاه است. به منظور ردیابی موثر ویروس برگ بادبزنی مو در تاکهاي آلوده چهار روش استخراج RNA با یکدیگر مقایسه و روش استخراج اسید نوکلي یک از این گیاه بهینه سازي شد. کیفیت اسید نوکلي یک استخراج شده به روشهاي اسپکتروفوتومتري و واکنش زنجیره اي پلی مراز با نسخه برداري معکوس تعیین شد. در بین روشهاي مورد مقایسه اختلاف زیادي در نتایج مشاهده شد به نحوي که بعضی از این روشها قادر به شناساي ی ویروس در بافت آلوده نبودند. در بین روشهاي مورد بررسی استفاده از CTAB-PVPP در بافر استخراج همواره بیشترین غلظت و بالاترین کیفیت اسید نوکلي یک را در پی داشت و ردیابی ویروس در اغلب نمونه ها امکان پذیر بود. واژههاي کلیدي: استخراج نوکلي یک اسید مقایسه ویروس برگ بادبزنی مو مقدمه ١ تاکنون بیش از 70 بیماري ویروسی و شبه ویروسی از مو گزارش شده است. اغلب این ویروسها در تیره هاي Closteroviridae Secoviridae Flexiviridae و Tymoviridae قرار دارند.(19) ولی جنسهاي Nepovirus و Amplovirus از نظر اقتصادي اهمیت بیشتري دارند و خسارت آنها تا 85 درصد محصول نیز می رسد (9). براي شناسایی ویروس هاي مو اغلب از آزمون الیزا استفاده می شود اما به دلیل غلظت پایین ویروسها در گیاهان آلوده طی ماه هاي گرم سال ) به ویژه در تابستان) الیزا حساسیت کافی براي شناسایی ویروس را ندارد (11). همچنین به دلیل عدم پراکنش یکسان ویروس در بخش هاي مختلف گیاه ردیابی ویروس با روشهاي سرولوژیکی با مشکلاتی همراه است (6) لذا روش هاي مبتنی بر ژنوم براي شناسایی و ردیابی ویروسهاي مو به کار گرفته می شود. استخراج RNA با کیفیت مناسب لازمه موفقیت در کاربرد روشهاي مولکولی مانند RT-PCR است (4). استخراج RNA با کیفیت مناسب از درختان و بخصوص مو به علت غلظت بالاي پلی ساکاریدها ترکیبات فنلی و سایر متابولیتهاي ثانویه با مشکلاتی همراه است (8 و 18). بعضی از روشهاي استخراج RNA در مو باعث تولید رسوب نامحلول میشود که نشان دهنده آلودگی هاي پروتي ینی است در حالیکه بعضی از روشها تولید رسوب ژله اي می کنند که نشان دهنده وجود پلی ساکاریدها است (21). همچنین بعضی از روشها در اثر وجود پلی فنلها تولید رسوب تیره رنگ می کنند (1 و 7). اتصال RNA استخراج شده به پلی ساکاریدها و مواد فنلی موجود در رسوب موجب ناپایداري آن عدم موفقیت در آزمایشهاي پاي ین دست از جمله RT-PCR میشود (18). روش هاي متعددي براي استخراج آر. ان. اي. از مو استفاده شده است (4 5 و 16). از موادي همچون CTAB کلرید سزیم و نمکهاي گوانیدین در روشهاي متعددي استفاده شده است. مک کنزي و همکاران (9) از کیتهاي تجاري براي استخراج آر. ان. اي. از درختان میوه آلوده به ویروس استفاده کردند که توانایی حذف ترکیبات بازدارنده را بطور موثر دارد. روحانی و همکاران نیز چهار روش را براي 2 استخراج آر. ان. اي. ویروس برگ بادبزنی مو مقایسه از دیگر روشها تثبیت پیکره هاي ویروس در از درختچه هاي مو کردند که تنها استفاده از فنل در استخراج کاراي ی داشت (16). محیط واکنش و حذف 3 مواد بازدارنده از طریق شستشو می باشد. این روش که IC-PCR نام دارد تلفیقی از روش هاي سرولوژیکی و پی سی آر است (12 24). روش Dot Blot(DB)-PCR نیز براي ردیابی GFLV نیز استفاده شده است (17). 2- Grapevine fanleaf virus-gflv 3- Immunocapture-PCR 1 و 2- دانشجوي کارشناسی ارشد بیماري شناسی گیاهی و استادیار گروه گیاهپزشکی دانشکده کشاورزي دانشگاه فردوسی مشهد -*) نویسنده مسي ول: (Email: zakiaghl@ferdowsi.um.ac.ir

128 نشریه حفاظت گیاهان (علوم و صنایع کشاورزي) جلد 30 شماره 1 بهار 1395 هر کدام از این روش هاي داراي مزایا و معایبی هستند. به عنوان مثال در روش مک کنزي و همکاران (9) از کیت هاي استخراج نوکلي یک اسید استفاده شده است که در سطح وسیع مقرون به صرفه نمی باشد. در روش روحانی و همکاران نیز از مواد شیمیاي ی خطرناك همچون فنل استفاده شده است (16). روش IC-PCR نیازمند آنتی بادي اختصاصی ویروس است. بعلاوه این روش وقت گیر است و براي تعداد زیاد نمونه ها جوابگو نیست (16). در روش DB-PCR پیکره ها مستقیما به دیواره لوله واکنش متصل شده و از آنجا که تمام مراحل شستشو و استخراج سنتز دي. ان. اي. مکمل و پی سی آر در یک لوله انجام می پذیرد که ریسک آلودگی به نوکلي ازها و تخریب اسید نوکلي یک ویروس وجود دارد که موجب کاهش دقت واکنش میشود (17). ویروس برگ بادبزنی مو یکی از مخرب ترین بیماري هاي ویروسی مو در سراسر دنیا است (15). ویروس برگ بادبزنی مو یکی از مخرب ترین بیماري هاي ویروسی مو در سراسر دنیا محسوب می شود. این ویروس به وسیله نماتد خنجري ریشه ) Xiphinema (index انتقال می یابد (14). موثر ترین روش کنترل بیماري با توجه به نحوه انتقال آن استفاده از قلمه هاي عاري از ویروس در تاکستانها است. این ویروس پراکنش وسیعی در اغلب تاکستانهاي کشور دارد. با توجه به تنوع ژنتیکی بالاي این ویروس و تفاوتهاي ژنوم جدایه ایرانی با جدایه هاي دیگر دنیا (12 15 13 و 22) ردیابی جدایه هاي ایرانی GFLV بوسیله آزمون RT-PCR با مشکلاتی همراه است. با طراحی آغازگرهاي اختصاصی بر اساس ترادف جدایه هاي ایرانی GFLV انتظار می رفت که ردیابی ویروس با مشکلات کمتري همراه باشد لیکن کیفیت پاي ین اسید نوکلي یک استخراج شده در آزمون RT- PCR ایجاد اختلال می کند. لذا اقدام به بهینه سازي و مقایسه روشهاي مختلف استخراج اسید نوکلي یک براي ردیابی GFLV در آزمون RT-PCR شد. در این بررسی پنج روش استخراج آر. ان. اي. شامل استفاده از کیت استخراج RNA تجاري استفاده از تریازول روش چهارم روحانی و همکاران (16) روش استخراج با (7) CTAB-PVPP و استخراج با استفاده از سیلیکون دي اکسید (2) از لحاظ کمیت و کیفیت اسید نوکلي یک استخراج شده و موفقیت در آزمون RT-PCR مورد مقایسه قرار گرفته اند. مواد و روش ها نمونه برداري طی بهار و تابستان سال 91 از تاکستان هاي استان خراسان رضوي نمونه برداري و تعداد 40 نمونه گیاهی مشکوك با علاي م آلودگی به GFLV جمع آوري شدند. آلودگی نمونه ها با استفاده از آنتی بادي اختصاصی GFLV در آزمون الیزاي مستقیم تاي ید شد.(11) استخراج آر. ان. اي. کل آر. ان. اي. کل از برگ هاي مشکوك به آلودگی با پنج روش خالص سازي شد. RNA استفاده از کیت استخراج 1 در این روش از کیت Column RNA Isolation Kit-I ساخت شرکت دنا زیست آسیا مطابق با دستورالعمل شرکت سازنده استفاده شد 2 استفاده از تریازول براي ساخت تریازول %38 فنول اسیدي 0/8 مول گوانیدین تیو سیانات 0/4 مولار آمونیوم تیو سیانات 0/1 مولار استات سدیم و %5 گلیسرول در یک لیتر آب مخلوط شده و پس از همگن شدن مخلوط در استخراج اسید نوکلي یک استفاده شد. مقدار 0/2 گرم از بافت برگ با استفاده از ازت مایع پودر شده و 2 میلی لیتر تریازول به آن افزوده و ورتکس شد. مخلوط حاصل براي 5 دقیقه در 7000 دور در دقیقه سانتریفوژ شده و به رونشین 0/1 حجم استات آمونیم و 0/8 حجم ایزوپروپانول اضافه شد و براي 30 دقیقه درºC 20 نگهداري شد. سپس لوله ها براي 15 دقیقه در 13000 دور بر دقیقه سانتریفوژ شده و رسوب حاصل پس از شستشو با الکل 70 درجه در 50 میکرولیتر بافر TE حل شد. 3 روش روحانی و همکاران (16 و 17) مقدار 0/2 گرم از بافت برگ در یک میلی لیتر بافر استخراج 21.7g K2HPO4.3H2O, 4.1g KH2PO4, 100g Sucrose, ) (1.5 g BSA, 20g PVP40, 5.3g Ascorbic acid, ph 7.6 به مدت 20-10 دقیقه در دماي اتاق قرار داده شد. بعد از هموژنیزه شدن کامل بافت برگ یک میلی لیتر دیگر از بافر استخراج اضافه و دوباره هموژنیزه شد. نمونه ها در 1000 دور در دقیقه به مدت 4 دقیقه سانتریفوژ شدند و فاز رویی به لوله هاي جدید منتقل و لوله ها در 13000 دور در دقیقه به مدت 20 دقیقه سانتریفوژ شدند. فاز رویی حذف شده و رسوب در 200 میکرولیتر بافر (10 TE میلی مولار EDTA با ph 8 50 میلی مولار تریس و 0/1 درصد 2- مرکاپتواتانول) حل شده و به آن 25 میکرولیتر سدیم دودسیل 1 سولفات % 10 اضافه شد. سپس لوله ها به مدت 10 دقیقه در C 60 نگهداري شده 80 میکرولیتر استات پتاسیم 5 مولار به لوله ها اضافه و مخلوط شدند. لوله ها به مدت 30 دقیقه روي یخ نگهداري شده سپس در 13000 دور در دقیقه به مدت 15 دقیقه سانتریفوژ و فاز رویی به لوله جدید منتقل شده و 0/1 حجم استات سدیم و هم حجم 1- Sodium Dodecyle Sulfate (SDS)

129 مقایسه روشهاي استخراج آر.آن. يا Guanidine Hydrochloride, 0.2 M Na Acetate ph 5, ( 25mM EDTA شستشو و سپس به مدت 30 ثانیه در سرعت 6500 دور در دقیقه رسوبدهی مجدد شد. در مرحله بعدرسوب در 500 میکرولیتر بافر 10 mm Tris, ph 8, 1 mm ) Wash II EDTA, 100 mm NaCl and absolute ethanol )حل شده و مجددا رسوبدهی انجام شد. این مرحله یکبار دیگر نیز تکرار شد. سپس لوله ها به مدت 2 دقیقه در 60 درجه سانتی گراد خشک شده و رسوب در 70 میکرولیتر بافر TE حل شد و براي 1 دقیقه در 65 درجه سانتی گراد قرار گرفت. در مرحله ي آخر میکروتیوب به مدت 5 دقیقه با سرعت 13000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد و فاز رویی حاوي اسید نوکلي یک به میکروتیوب جدید انتقال داده شد. آن ایزوپروپانول سرد اضافه شد و در C 20- به مدت یک ساعت نگهداري شده و در 13000 دور در دقیقه به مدت 20 دقیقه سانتریفوژ شدند. رسوب با 200 میکرولیتر از اتانول سرد % 80 شستشو داده شده و پس از خشک شدن در 30 میکرولیتر آب مقطر استریل حل شد. CTAB-PVPP روش 4 از این روش در استخراج اسید نوکلي یک از برگ پنبه استفاده شده بود (7) که با مختصر تغییراتی براي مو بهینه سازي شده است. مقدار 20 میلی گرم از بافت برگ در 700 میکرو لیتر بافر استخراج ) 0.1M 200 mm GuanidinThiocynate, 1.4M Nacl, (Tris-Hcl PH=7, 1% PVP 1 40, 2% CTAB با دماي 60 درجه سانتی گراد درون هاون استریل عصاره گیري و 5 میکرولیتر 2- مرکاپتواتانول به آن اضافه شد. عصاره به میکروتیوب حاوي 0/05 گرم PVPP 2 منتقل شده و پس از مخلوط شدن به مدت 5-10 دقیقه در 60 درجه سانتی گراد نگهداري و سپس براي 2 دقیقه در سرعت 13000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. 500 میکرولیتر از رونشین به میکروتیوب جدید منتقل شد و 400 میکرولیتر کلروفرم به آن اضافه و بعد از همگن سازي به مدت 2 دقیقه با سرعت 13000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. رونشین به میکروتیوب جدید منتقل شده و 0/1 حجم استات آمونیوم و هم حجم آن ایزوپروپانول سرد اضافه شد و به مدت 30 دقیقه در دماي 20- درجه سانتی گراد نگهداري شد. سپس لوله ها با سرعت 13000 دور در دقیقه به مدت 20 دقیقه در دماي 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ شدند. رسوب در 1 میلی لیتر اتانول %70 شستشو داده شد و سپس لوله ها به مدت 2 دقیقه در 60 درجه سانتی گراد خشک شده و رسوب در 70 میکرولیتر بافر TE حل شد. 5 استفاده از سیلیکون دي اکسید (2) مقدار 150 میلی گرم از بافت برگ در 1 میلی لیتر بافر استخراج 4M Guanidine Hydrochloride, 0.2 M Na Acetate ph 5, ) PVP-40 (25mM EDTA, 2.5% درون هاون استریل عصاره گیري و 5 میکرولیتر 2 -مرکاپتواتانول اضافه شد. عصاره به میکروتیوب منتقل شده و به مدت 2 دقیقه در سرعت 6800 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. 500 میکرولیتر از فاز رویی به میکروتیوب جدید حاوي 60 میکرولیتر سارکوسیل 20 درصد منتقل شد و پس از مخلوط کردن به مدت 20 دقیقه در 65 درجه سانتی گراد نگهداري و سپس به مدت 5 دقیقه با سرعت 13000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. 350 میکرولیتر از رونشین به میکروتیوب حاوي 20 میکرولیتر سیلیکا انتقال داده شد و بعد از همگن سازي 315 میکرولیتر اتانول مطلق به مخلوط اضافه شد. لوله ها به مدت 30 ثانیه در سرعت 6500 دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند ورسوب با 600 میکرولیتر بافر 4M ) Wash I بررسی کیفیت اسید نوکلي یک کیفیت اسید نوکلي یک خالص سازي شده با سه روش نسبت جذب 260/280 نسبت جذب 1) 260/230 18 10 7 و (21 و ردیابی ویروس در RT-PCR بررسی شد. نسبت جذب 260/280 نشان دهنده مقدار آلودگی به پروتي ین در نمونه است در حالیکه نسبت جذب 260/230 براي سنجش میزان پلی ساکاریدها و پلی فنل ها کاربرد دارد. بهینه سازي آرتی-پی سی آر (RT-PCR) براي سنتز رشته مکمل (cdna) 3 میکرولیتر از آر. ان. اي. کل استخراج شده با 2 میکرولیتر آغازگر عمومی (T) Oligod و 9/5 میکرولیتر آب دیونیزه مخلوط و میکروتیوب دردماي 60 درجه به مدت 10 دقیقه قرار داده شد. سپس 2 میکرولیتر مخلوط dntps 4 میکرولیتر بافر 5x واکنش و 0/5 میکرولیتر آنزیم نسخه بردار معکوس Transcriptase) (MMuLV-Reverse به مخلوط اضافه گردیده و میکروتیوب به مدت 60 دقیقه در دماي 47 درجه ترموسایکلر قرار گرفت (13 و 3). واکنش زنجیره اي پلیمراز با استفاده از آغازگر هاي طراحی شده 5'-) DetR و (5'-CGGCAGACTGGCAAGCTGT-3') DetF (GGTCCAGTTTAATTGCCATCCA-3' براي تکثیر قسمتی از ژن پروتي ین پوششی انجام شد. حجم نهایی واکنش 20 میکرولیتر شامل 3 میکرولیتر از cdna 1 میکرولیتر از هر آغازگر 2 میکرولیتر 0/4 MgCl2 1/2 میکرولیتر 50) میلی مولار) 10 PCR buffer میکرولیتر مخلوط dntps و 0/2 میکرولیتر (5 واحد در میکرو لیتر) Taq DNA Polymerase بود. پروفایل دمایی واکنش زنجیره اي پلیمراز شامل یک چرخه در دماي C 95 به مدت 3 دقیقه و 30 چرخه شامل C 95 به مدت 30 ثانیه در مرحله واسرشت سازي C 56 به مدت 45 ثانیه و C 72 به مدت 80 ثانیه و در نهایت یک سیکل C 72 به مدت 15 دقیقه با استفاده از ترموسایکلر انجام گردید. 2- Polyvinylpyrolidon 3- Polyvinylpolypyrolidon

130 نشریه حفاظت گیاهان (علوم و صنایع کشاورزي) جلد 30 شماره 1 بهار 1395 شکل 1- علاي م ویروس برگ بادبزنی مو در تاکهاي آلوده Figure 1- Symptoms of GFLV in infected grapevine جدول 1- مقایسه کمیت و خلوص اسید نوکلي یک استخراج شده از روشهاي مختلف از برگ مو Table 1- Comparison of yield and quality from various methods of RNA isolation from grapevine leaves جذب نوري مقدار آر. ان اي روش استخراج Absorbance RNA yield Extraction methods 260/280 260/230 (ng/ l) کیت تجاري Commercial kit 2.03 1.47 557 Trizol 1.86-2.17 1.3-2.87 499 CTAB 1.7-2 0.9-1.94 235.5-300 Rowhani et al. 2.3-4 0.4-1.04 33.3-77.2 سیلیکا Silica 1.1-2 1.59 11.5-51.8 به منظور بررسی نتایج آرتی- پی سی آر 5 میکرولیتر از محصول Green viewer در ژل آگارز 1 درصد حاوي 2 میکرولیتر از PCR الکتروفورز و در نهایت در دستگاه ژل داك عکسبرداري شد. نتایج و بحث علایم GFLV شامل رگبرگ نواري و موزاي یک زرد (شکل 1) در مناطق نمونه برداري مشاهده شد که با علایم توصیف شده براي GFLV در منابع (14 و 23) به طور کامل تطابق داشت. از 40 نمونه جمع آوري شده 25 نمونه در آزمون الیزاي مستقیم آلوده به GFLV تشخیص داده شدند. در این نمونه ها میزان تغییر رنگ ماده زمینه 2-3 برابر شاهد منفی بود. بررسی کمیت و کیفیت اسید نوکلي یک استخراج شده میزان اسید نوکلي یک استخراج شده بسته به روش استخراج بکار برده شده متغیر بود (جدول 1). استفاده از کیت استخراج RNA تریازول و روش CTAB-PVPP بیشترین میزان اسید نوکلي یک را از برگ مو استخراج کردند μg/g) 235/5-300) در حالیکه در روش سیلیکا کمترین غلظت اسید نوکلي یک از برگ استخراج شد μg/g) 11/5-51/8). روش استخراج روحانی و همکاران نتایج بینابینی داشت و از بافت تازه برگ 33/3-77/2 μg/g اسید نوکلي یک خالص سازي شد (جدول 1). روش CTAB-PVPP از این لحاظ بیشترین کاراي ی را در بین سایر روشها داشت. کیفیت اسید نوکلي یک خالص سازي شده با سه روش محاسبه نسبت جذب 260/280 نانومتر نسبت جذب 260/230 نانومتر و ردیابی ویروس در RT-PCR بررسی شد. کمترین نسبت جذب 260/280 در روش استخراج با سیلیکا مشاهده شد (2 1/1) ولی در سایر روشهاي استخراج بکار برده شده این نسبت بالاتر از 1/8 بود و اختلاف معنی داري در بین روشهاي مختلف مشاهده نشد. لیکن نسبت جذب 260/230 در بین روشهاي مختلف تفاوت داشت. بیشترین نسبت در روشهاي استخراج تریازول و CTAB-PVPP مشاهده شد. کمترین نسبت جذب 260/230 در روش فنل مشاهده شد و میزان جذب در استفاده از کیت استخراج و سیلیکا بینایبنی بود (جدول 1). همانند سازي در آرتی-پی سی آر واکنش نسخه برداري معکوس با آغازگر d(t) Oligo و بدنبال آن آزمون پی سی آر با آغازگرهاي DetF و DetR در 25 نمونه که در آزمون الیزا آلوده تشخیص داده شده بودند براي بررسی کاراي ی

131 مقایسه روشهاي استخراج آر.آن. يا روش استخراج بکار برده شده در ردیابی ویروس از بافت مو استفاده شد. با استفاده از کیت استخراج آر. نا.اي تجاري ویروس برگ بادبزنی مو تنها در چهار نمونه الیزا مثبت (16 درصد از نمونه ها) ردیابی شد. استفاده از روش سیلیکا در استخراج آر. ان. اي. منجر به تولید قطعه اي به طول 1000bp از ژن پروتي ین پوششی GFLV در 40 درصد از نمونه ها (10 نمونه) شد درحالیکه با استفاده از روشهاي تریازول و روحانی و همکاران در استخراج اسید نوکلي یک GFLV بترتیب در 60 و 56 درصد از نمونه هاي آلوده ردیابی شد. در استفاده از روش CTAB-PVPP در 88 درصد از نمونه هاي جمع آوري شده (22 نمونه) قطعه 1000bp پروتي ین پوششی GFLV همانند سازي شد که نشان دهنده ي کارآمدتر بودن این روش نسبت به سایر روشهاي مورد بررسی است (جدول 2). بحث هدف از این تحقیق مقایسه روشهاي استخراج اسید نوکلي یک و بهینه سازي آرتی- پی سی آر جهت ردیابی GFLV در بافتهاي مو با استفاده از واکنش زنجیرهاي پلیمراز بود. کاهش غلظت ویروس در بافتهاي مو در فصول گرم موجب کاهش حساسیت روشهاي سرولوژیکی در شناساي ی ویروس می شود. روشهاي مولکولی امکان شناساي ی ویروس در تمامی فصول سال را فراهم میکنند (11 16 و 17). واکنش زنجیرهاي پلیمراز داراي حساسیت زیادي در ردیابی بیمارگرهاي گیاهی و از جمله GFLV است. استفاده از روشهاي معمول استخراج اسید نوکلي یک براي ردیابی ویروسهاي مو و از جمله GFLV توام با موفقیت نیست هر چند استفاده از این روشها در میزبانهاي علفی براحتی موجب شناساي ی ویروس می شود (4 16 9 و 17). بافتهاي مختلف مو داراي مقادیر زیادي از پلی فنلها و پلی ساکاریدها هستند. این ترکیبات در عملکرد اسید نوکلي یک ایجاد اختلال کرده و به عنوان بازدارنده هاي واکنش زنجیره اي پلیمراز عمل می کنند. روشهاي استخراج مختلف از لحاظ تواناي ی حذف ترکیبات بازدارنده واکنش آرتی- پی سی آر در این تحقیق مقایسه شده اند. بیشترین غلظت RNA با استفاده از کیت استخراج RNA تریازول و CTAB-PVPP بدست آمد لیکن کاربرد روشهاي روحانی و همکاران و سیلیکا در استخراج اسید نوکلي یک با غلظت بالا از بافتهاي مو توام با موفقیت نبود. جلوگیري از تخریب و اکسیداسیون RNA بر راندمان خالص سازي اسید نوکلي یک تاثیر گذار است (1 8 18 و 20). چنین به نظر میرسد که بافر عصاره گیري در این دو روش موثر عمل نکرده به نحوي که غلظت اسید نوکلي یک استخراج شده نسبت به سایر روشها کاهش چشمگیري داشته است. همه روشهاي مورد بررسی در حذف پروتي ین از پرپارسیون موفق بودند به طوري که نسبت جذب 260/280 در اغلب نمونه ها بیشتر از 1/8 بود. از این نظر روش سیلیکا تغییرات زیادي داشت و نسبت به روشهاي دیگر کاراي ی مناسبی نداشت. نسبت جذب 260/230 براي سنجش میزان پلی ساکاریدها و پلی فنل ها کاربرد دارد. هر چه این نسبت بزرگتر باشد نشان دهنده خلوص بیشتر نمونه و حذف پلی ساکاریدها از پرپارسیون است (1 8 18 و 20). از بین روشهاي مورد بررسی استخراج با تریازول و CTAB-PVPP بهترین راندمان حذف پلی ساکاریدها را داشتند در حالیکه روش روحانی و همکاران کمترین کاراي ی را از این نظر داشت. البته فاکتورهاي ی همچون غلظت اسید نوکلي یک نسبت جذب 260/280 و 260/230 شاخصهاي خوبی براي موفقیت در RT-PCR نیستند (1 18 16 9 8 2 و 20). از لحاظ کیفیت مناسب اسید نوکلي یک براي PCR استخراج با CTAB-PVPP با ردیابی ویروس در 88 درصد از نمونه ها بهترین روش استخراج بود در حالیکه کمترین موفقیت در شناساي ی مربوط به استخراج با کیت تجاري و روش سیلیکا بود. روشهاي تریازول و روحانی و همکاران موجب خرد شدن اسید نوکلي یک شده و واکنش پلی مراز را تحت تاثیر قرار میدهند (1 8 و 18) همچنین نمونه هاي خالص شده با سیلیکا به مقادیر زیادي از پروتي ین و پلی ساکارید آلوده بودند که از بازدارندگان واکنش پلی مراز هستند (1 8 و 18). نتایج این تحقیق نشان داد که روش هاي استفاده از کیت استخراج روش روحانی و همکاران و استفاده از سیلیکا قادر به حذف مواد بازدارنده از جمله پلی ساکاریدها و ترکیبات فنلی موجود در بافتهاي مو نبودند در حالیکه روش CTAB-PVPP بطور قابل توجهی براي استخراج اسید نوکلي یک از مو کارایی مناسبی داشت. عدم تکثیر قطعه 1000 جفت بازي در واکنش آرتی-پی سی آر از نمونه هاي ی که آلودگی آنها در آزمون الیزا محرز شده بود ناشی از ناکارآمدي روش استخراج آر. ان. اي. از آنها بوده است. استخراج آر. ان. اي. با استفاده از روشهاي کیت استخراج RNA روش روحانی و همکاران و استفاده از سیلیکا موجب حذف مواد بازدارنده ترکیبات فنلی و پلی ساکاریدها از عصاره گیاهان آلوده نشده و این ناخالصی ها در انجام آرتی-پی سی آر در عمل آنزیم ها اختلال ایجاد کرده اند. در مجموع روش CTAB-PVPP داراي نتایج یکنواخت تر با تکرار پذیري زیاد نسبت به سایر روشهاي مورد استفاده بود و ردیابی ویروس به سهولت امکان پذیر بود. همانندسازي قطعه ي 1000 جفت بازي و فقدان آن در نمونه سالم دلالت بر اختصاصی بودن آغازگر طراحی شده در این تحقیق داشت. با توجه به تنوع ژنتیکی زیاد این ویروس (5 13 12 و 15) و بروز مشکلاتی در زمینه شناسایی آن به وسیله ي آزمون RT-PCR که ناشی از عدم اتصال آغازگر به رشته

132 نشریه حفاظت گیاهان (علوم و صنایع کشاورزي) جلد 30 شماره 1 بهار 1395 الگو می باشد آغازگر فوق با توجه به ترادف جدایه هاي ایرانی موجود در بانک ژن و سایر ایزوله هاي GFLV طراحی شده است و این آغازگر می تواند مشکلات مربوط به شناسایی جدایه هاي مختلف این ویروس را مرتفع سازد. حساسیت و سهولت روش اراي ه شده در استخراج اسید نوکلي یک و شناساي ی ویروس به روش واکنش زنجیره اي پلی مراز امکان استفاده از آن را در سیستمهاي گواهی قلمه امکانپذیر می کند. روش استخراج اسید نوکلي یک اراي ه شده در این تحقیق می تواند در تسهیل استفاده از تکنولوژي مولکولی در شناساي ی ویروسهاي مو موثر واقع شود. جدول 2- مقایسه کارایی روشهاي استخراج آر..اي در ردیابی ویروس برگ بادبزنی مو از برگ مو نا Table 2- Comparison of efficiency of various RNA extraction methods in detection of GFLV from grapevine leaves روش استخراج Extraction methods No. ELISA positive samples No. RT-PCR positive samples % موفقیت درRT-PCR %RT-PCR success کیت تجاري Commercial kit 25 4 16 Trizol 25 15 60 CTAB 25 22 88 Rowhani et al. 25 14 56 سیلیکا Silica 25 10 40 M ١ ٢ ٣ Generuler DNA ladder الکتروفروز محصول RT-PCR با آغازگرهاي اختصاصی ویروس برگ بادبزنی مو DetF) M:.(DetR / mix, Fermentas شماره 1: روش روحانی و همکاران شماره 2: روش CTAB شماره 3: روش سیلیکا شکل 2- Figure 2- Results of RT-PCR using GFLV specific primer pairs (DetF / DetR). :Generuler DNA ladder mix, Fermentas; 1: extraction using Rowhani et al. Method; 2: extraction using CTAB method; 3: extraction using Silica method 1- Bahloul M., and Burkard G.1993. An improved method for the isolation of total RNA from spruce tissues. Plant Molecular Biology Reporter, 11:212-215. 2- Boom R., Sol C.J.A., Salimans M.M.M., Jansen C.L., Wertheim-van Dillen P.M.E., Van der Noordaa. J. 1990. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of Clinical Microbiology, 28:495-503. 3- Fattouch S., Acheche H., Mhirsi S., Mellouli L., Bejar S., Marrakchi M., and Marzouki N. 2005. RT-PCR RFLP for genetic diversity analysis of Tunisian Grapevine fanleaf virus isolates in their natural host plants. Journal of Virological Methods, 127:126 132. 4- Gambino G., Perrone I., and Gribaudo I. 2008. A rapid and effective method for RNA extraction from different tissues of grapevine and other woody plants. Phytochemical Analysis, 19: 520 525. منابع

133 مقایسه روشهاي استخراج آر.آن. يا 5- Hajizadeh M., Sokhandan-bashir N., Niknam A., and Nikkhah Sh. 2007. Optimization of Nucleic Acid Extraction and RT-PCR for Detection of Grapevine fanleaf virus Isolates from Vineyards in North-West of Iran. Journal of Agricultural Science. 16: 145-156. 6- Hewitt W.B., Raski D.J., and Goheen A.C. 1958. Nematode vector of soil-borne fanleaf virus of grapevines. Phytopathology, 48:586-595. 7- Katterman F.R., and Shattuck V.I. 1983. An effective method of DNA isolation from the mature leaves of Gossypium species that contain large amounts of phenolic terpenoids and tannins. Preparative Biochemistry and Biotechnology, 13: 347-359. 8- Loulakakis K.A. Roubelakis-Angelakis K.A. and A.K. Kanellis. 1996. Isolation of functional RNA from grapevine tissues poor in nucleic acid content. American Journal of Enology and Viticulture, 47: 181-185. 9- MacKenzie D.J., Mclean M.A., Mukerji S., and Green M. 1997. Improved RNA extraction from woody plants for the detection of viral pathogens by reverse transcription-polymerase chain reaction. Plant Disease, 81:222-226. 10- Martelli G.P. 1993a. Grapevine degeneration - fanleaf. In: Martelli G.P. (ed). Graft -transmissible diseases of grapevines. Handbook for detection and diagnosis pp. 9-18. Food and Agriculture Organization of the United Nations Rome Italy. 11- Martelli G.P. 1993b. Graft-transmissible disease of grapevines. Handbook for detection and diagnosis. (Ed) G. P. Martelli (p. 263) FAO. Roma. 12- Naraghi-Arani P., Daubert S., and Rowhani A. 2001. Quasispecies nature of the genome of Grapevine fanleaf virus. Journal of General Virology, 82:1791-1795. 13- Noorinejad Zarqani Sh., Shamsbakhsh M., Sokhandan bashir N., and Pajoohandeh M. 2012. Identification and detection of Iranian osplates of Grapevine fanleaf virus using green-gfafting and RT-PCR. Iranian journal of Plant pathology, 48:381-391. 14- Raski D.J., Goheen A.C., Lider L.A., and Meredith C.P. 1983. Strategies against Grapevine fanleaf virus and its nematode vector. Plant Disease, 67:335-340. 15- Ritzenthaler C., Viry M., Pinck M., Margis R., Fuchs M., and Pinck L. 1991. Complete nucleotide sequence and organization of grapevine fanleaf nepovirus RNA1. Journal of General Virology, 72:2357-2365. 16- Rowhani A., Chay C., Golino D.A., and Falk W. 1993. Development of a polymerase chain reaction technique for the detection of Grapevine fanleaf virus in grapevine tissue. Phytopathology, 83:749-753. 17- Rowhani A., Manangas M.A., Lile L.S., Daubert S.D., and Golino D.A. 1995. Development of a detection system for viruses of woody plants based on PCR analysis of immobilized virions. Phytopathology, 85: 47-352. 18- Salzman R.A., Fujita T., Zhu-Salzman K., Hasegawa P.M., and Bressan R.A. 1999. An improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates. Plant Molecular Biology Reporter, 17:11-17. 19- Sanfacon H., Wellink J., Le Gall O., Karasev A., van der Vlugt R., and Wetzel T. 2009. Secoviridae: a proposed family of plant viruses within the order Picornavirales that combines the families Sequiviridae and Comoviridae, the unassigned genera Cheravirus and Sadwavirus, and the proposed genus Torradovirus. Arcives of Virology, 154:899-907. 20- Tattersall E., Ergul A.R., AlKayal A.F., DeLuc L., Cushman J.C., and Cramer G.R. 2005. Comparison of methods for isolating high-quality RNA from leaves of grapevine. American Journal of Enology and Viticulture, 56:400-407. 21- Tesniere C., and Vayda M.E. 1991. Method for the isolation of high-quality RNA from grape berry tissues without contaminating tannins or carbohydrates. Plant Molecular Biology Reporter, 9:242-251. 22- Vigne E., Komar V., and Fuchs M. 2004b. Field safety assessment of recombination in transgenic grapevines expressing the coat protein gene of Grapevine fanleaf virus. Transgenic Reearch, 13:165-179. 23- Vuittenz A. 1970. Fanleaf of grapevine. In: N. W. Frazier (ed). Virus disease of small fruits and grapevine. University of California, Berkeley, pp. 217-228. 24- Wetzel T.R., Jardak L., Meunier A., Ghorbel G., Reustle M., and Krczal G. 2002. Simultaneous RT-PCR detection and differentiation of arabis mosaic and Grapevine fanleaf nepovirus in grapevine with a single pair of primers. Journal of General Virology, 101: 63-69.